A ligase RNA T4 une 3',5'-bisfosfatos de 2'-desoxiribonucleosídeos a oligodesoxiribonucleotídeos

A ligase RNA T4 catalisa a adição dependente de ATP de um único 3',5'-bisfosfato de 2'-desoxiribonucleosídeo ao 3'-hidroxilo de um oligodesoxiribonucleotídeo. O bisfosfato é unido ao deoxioligômero por uma ligação fosfodiéster 3' para 5' e o produto, que é terminado por um 3'-fosfato, é um nucleotídeo mais longo que o substrato. Os bisfosfatos de dAdo, dCyd, dGuo, dThd e dUrd são doadores e os oligodesoxiribonucleotídeos com terminais 3' de dA, dC, dG, dT ou dU atuam como aceitores. O resíduo preferido tanto para o doador quanto para o receptor é dCyd. Deoxiolegômeros com comprimento de 3 a 12 resíduos são ativos como aceitores. Para obter bons rendimentos, são necessárias altas concentrações de enzima, longos tempos de incubação a baixa temperatura e íons manganês em vez de íons Mg(II). Sob condições ótimas, os rendimentos calculados em relação ao deoxiolegômero convertido em produto variam de 40 a mais de 95%. O número de turnover da enzima para juntamento de DNA é extremamente baixo, mas, como a preparação é quase isenta de DNases, há menos de 3% de degradação do substrato ou produto após 6 dias de reação. Antecipamos que esta reação servirá como base para um método de síntese enzimática passo a passo de DNA de sequência definida.