Caracterização de espectros de mutação com pirosequenciamento ultra profundo: Aplicação à resistência a medicamentos do HIV-1

A detecção de espectros mutantes dentro de uma população de microrganismos é crítica para o manejo de infecções resistentes a medicamentos. Realizamos pirosequenciamento ultra profundo para detectar variantes de sequência menores nos genes da protease e da transcriptase reversa (RT) do HIV-1 a partir de amostras clínicas de plasma. Estimamos taxas de erro empíricas a partir de quatro clones de plasmídeo do HIV-1 e as utilizamos para desenvolver uma abordagem estatística para distinguir variantes menores autênticas de erros de sequenciamento em oito amostras clínicas. O pirosequenciamento ultra profundo detectou uma média de 58 variantes por amostra em comparação com uma média de oito variantes por amostra detectadas pelo sequenciamento convencional dideoxiribonucleotídeo por PCR direta. Na amostra clínica com o maior número de variantes de sequência menores, todas as 60 variantes presentes em > ou =3% dos genomas e 20 das 35 variantes presentes em <3% dos genomas foram confirmadas por sequenciamento por diluição limitante. Com a análise apropriada, o pirosequenciamento ultra profundo é um método promissor para caracterizar a diversidade genética e detectar variantes menores, mas clinicamente relevantes, em amostras biológicas com populações genéticas complexas.