Instantâneas de uma polimerase de DNA evoluída antes e depois da incorporação de um nucleotídeo não natural

O próximo desafio na biologia sintética é ser capaz de replicar sequências sintéticas de ácidos nucleicos de forma eficiente. O par sintético, 2-amino-8-(1-beta-d-2'-deoxiribofuranosil) imidazo 1,2-a-1,3,5-triazin-8H-4-ona (designado trivialmente como P) com 6-amino-3-(2'-deoxiribofuranosil)-5-nitro-1H-piridin-2-ona (designado trivialmente como Z), é replicado por certas polimerases da Família A, embora com menor eficiência. Através da evolução direcionada, identificamos uma variante da polimerase KlenTaq (M444V, P527A, D551E, E832V) que incorpora dZTP em frente ao P de forma mais eficiente do que a enzima tipo selvagem. Aqui, relatamos duas estruturas cristalinas dessa variante KlenTaq, um complexo pós-incorporação que inclui um molde-primer com P:Z preso no sítio ativo (complexo binário) e um complexo pré-incorporação com dZTP pareado ao molde P no sítio ativo (complexo ternário). Ao formar o complexo ternário, o domínio dos dedos apresenta um ângulo de fechamento maior do que nos complexos naturais, mas se conecta ao molde-primer e ao dNTP de entrada através de interações semelhantes. No complexo binário, embora muitas das interações encontradas nos complexos naturais sejam mantidas, há um movimento relativo aumentado do domínio do polegar. Coletivamente, nossas análises sugerem que é o complexo pós-incorporação para substratos não naturais que apresenta um desafio para a enzima natural e que a replicação mais eficiente dos pares P:Z requer uma polimerase mais flexível.