Um modelo sigmoidal baseado em cinética para a reação em cadeia da polimerase e sua aplicação à PCR quantitativa absoluta em tempo real de alta capacidade

FUNDAMENTOS: Com base na definição de um ponto de referência comum, as tecnologias atuais de PCR quantitativa em tempo real comparam diferenças relativas na posição do perfil de amplificação. Assim, a quantificação absoluta requer a construção de curvas padrão específicas para o alvo que são altamente intensivas em recursos e propensas a introduzir erros quantitativos. A modelagem sigmoidal usando regressão não linear demonstrou anteriormente que a quantificação absoluta pode ser realizada sem curvas padrão; no entanto, erros quantitativos causados por distorções na fase de platô impediram a implementação eficaz dessa abordagem alternativa. RESULTADOS: O reconhecimento de que a taxa de amplificação é linearmente correlacionada à quantidade de amplicon levou à derivação de duas funções sigmoides que permitem a quantificação do alvo por meio da análise de regressão linear. Além de contornar erros quantitativos produzidos por distorções do platô, essa abordagem permite a determinação da eficiência de amplificação dentro de reações de amplificação individuais. A quantificação absoluta é realizada primeiro convertendo leituras individuais de fluorescência em quantidade do alvo expressa em unidades de fluorescência, seguida da conversão no número de moléculas do alvo através de calibração óptica. Baseado na expressão da fluorescência da reação em relação à massa do DNA do amplicon, um elemento seminal deste estudo foi implementar calibração óptica usando lambda gDNA como um padrão quantitativo universal. Isso não só elimina a necessidade de preparar padrões quantitativos específicos para o alvo, como também relega o estabelecimento da escala quantitativa a uma única entidade altamente definida. A competência quantitativa dessa abordagem foi avaliada utilizando o "ensaio de diluição limitante" para quantificação absoluta, que forneceu um padrão ouro independente para verificar a precisão quantitativa. Isso gerou evidências substanciais que as precisões absolutas de +/- 25% podem ser alcançadas rotineiramente. A comparação com os pacotes de processamento de dados qPCR automatizados LinReg e Miner demonstrou ainda mais o desempenho superior dessa metodologia baseada em cinética. CONCLUSÃO: Chamado de "regressão linear da eficiência" ou LRE, essa nova abordagem cinética confere a capacidade de realizar quantificação absoluta de alta capacidade com capacidades de controle de qualidade sem precedentes. A simplicidade computacional e a natureza recursiva da quantificação LRE também a torna favorável à implementação em software, como demonstrado por um programa prototípico em Java que automatiza a análise de dados. Isso, por sua vez, introduz a perspectiva de realizar quantificação absoluta com pouco esforço adicional além do necessário para a preparação das reações de amplificação.