Determinação da Frequência de Alelos de SNP em Alta Vazão em Amostras de DNA Agrupadas por PCR Cinética

Desenvolvemos um método preciso, porém barato e de alta vazão, para determinar a frequência de alelos de polimorfismos bialélicos em pools de amostras de DNA. O ensaio combina PCR cinética (quantitativa em tempo real) com amplificação específica de alelos e não requer processamento pós-PCR. As quantidades relativas de cada alelo em uma amostra são quantificadas. Isso é realizado dividindo aliquotas iguais do DNA agrupado entre duas reações de PCR separadas, cada uma contendo um par de primers específico para uma ou outra variante SNP alelica. Para pools com quantidades iguais dos dois alelos, as duas ampliações devem atingir um nível detectável de fluorescência no mesmo número de ciclos. Para pools que contêm razões desiguais dos dois alelos, a diferença no número de ciclos entre as duas reações de amplificação pode ser usada para calcular as quantidades relativas de alelos. Demonstramos a precisão e confiabilidade do ensaio em amostras com frequências de alelos SNP predeterminadas conhecidas variando de 5% a 95%, incluindo pools de DNAs de humanos e camundongos utilizando um total de oito SNPs diferentes. A precisão na medição das frequências de alelos conhecidos é muito alta, com a força da correlação entre as frequências medidas e conhecidas apresentando um r(2) = 0,997. A perda de sensibilidade devido a erro de medição é tipicamente mínima, comparada àquela apenas devido ao erro de amostragem, para amostras populacionais de até 1000. Acreditamos que, ao fornecer um meio para genotipagem de SNP em até milhares de amostras simultaneamente, de forma econômica e reproduzível, este método é uma estratégia poderosa para detectar diferenças polimórficas significativas em estudos de associação de genes candidatos e varreduras de desequilíbrio de ligação em todo o genoma.