Seletividade e Promiscuidade na Oxidação Mediada por TET da 5-Metilcitosina em DNA e RNA

As enzimas da família de translocação dez-onze (TET) adicionam diversidade ao repertório de modificações de nucleobases ao catalisar a oxidação de 5-metilcitosina (5mC). As enzimas TET foram inicialmente encontradas oxidando 5-metil-2'-deoxicitidina no DNA genômico, gerando produtos que contribuem para a regulação epigenética em células mamíferas, mas desde então também foram encontradas oxidando 5-metilcitosina no RNA. Considerando as diferentes configurações de DNA e RNA de fita simples (ss) e fita dupla (ds) que coexistem em uma célula, definir o alcance da atividade preferencial do TET e os mecanismos de seletividade de substrato é crítico para entender melhor as funções biológicas das enzimas. Para esse fim, examinamos sistematicamente a atividade da TET2 humana em substratos de DNA, RNA e híbridos in vitro. Descobrimos que, enquanto ssDNA e ssRNA são bem tolerados, a TET2 é mais proficiente na oxidação de dsDNA e discrimina fortemente contra dsRNA. Substratos quiméricos e híbridos contendo características mistas de DNA e RNA ajudaram a revelar duas características principais pelas quais a enzima discrimina entre os substratos. Primeiro, a identidade do nucleotídeo-alvo é o mais forte determinante de reatividade, com uma preferência por 5-metildesoxicitidina, enquanto tanto DNA quanto RNA são relativamente tolerados no resto da fita-alvo. Em segundo lugar, enquanto uma fita complementar não é necessária para a atividade, o DNA é o parceiro preferido, e o RNA complementar diminui a reatividade. Nossa análise bioquímica, complementada por simulações de dinâmica molecular, fornece suporte para um sítio ativo otimamente configurado para reatividade de dsDNA, mas permissivo para várias configurações de ácido nucleico, sugerindo uma ampla gama de papéis plausíveis para a oxidação mediada por TET de 5mC nas células.