Processamento in vitro do pro-subtilisina produzido em Escherichia coli.

Em um trabalho anterior (Ikemura, H., Takagi, H., e Inouye, M. (1987) J. Biol. Chem. 262, 7859-7864), demonstramos que a pro-sequência composta por 77 resíduos de aminoácidos no terminus amino da subtilisina é essencial para a produção de subtilisina ativa. Quando os agregados de pro-subtilisina produzidos em Escherichia coli foram solubilizados em 6 M de cloridrato de guanidina e dialisados contra tampão de fosfato de sódio a 200 mM (pH 7.1 ou 6.2), a pro-subtilisina foi eficientemente processada para subtilisina ativa. Quando mais de 14 resíduos foram removidos do terminus amino da pro-sequência, a subtilisina ativa não foi mais produzida, como nos experimentos in vivo. Da mesma forma, a subtilisina ativa não retornaria às condições nativas sob as mesmas condições uma vez solubilizada em cloridrato de guanidina. Quando o resíduo de ácido aspártico no local ativo (Asp32) foi alterado para asparagina, o processamento da pro-subtilisina mutante não foi observado mesmo na presença da pro-subtilisina de tipo selvagem. Inibidores como o fluorofenoisometano ou o inibidor de subtilisina de Streptomyces não bloquearam o processamento da pro-subtilisina de tipo selvagem. Esses fatos indicam que o processamento da pro-subtilisina é realizado por um mecanismo intramolecular de auto-processamento. Quando a amostra foi dialisada contra fosfato de sódio a 20 mM (pH 6.2), nenhuma subtilisina ativa foi encontrada, sugerindo que a natureza altamente carregada da pro-sequência desempenha um papel importante no processo de refolding da pro-subtilisina desnaturada.