Separação do "Domínio de Sinalização de Glicosfingolipídeos" da Fração de Membrana Contendo Caveolina em Células de Melanoma Murino B16 e Seu Papel na Adesão Celular Associada à Sinalização

Duas subfrações de membrana, uma enriquecida em gangliosídeo GM3 e a outra contendo caveolina, foram separadas da fração de membrana insolúvel em detergente de baixa densidade preparada por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose da fração posnuclear de células de melanoma murino B16. A subfração enriquecida em GM3, separada pela anticorpo monoclonal anti-GM3 DH2, continha esfingomielina, colesterol, c-Src e Rho A, mas não caveolina. Em contraste, a subfração contendo caveolina, separada pelo anticorpo anti-caveolina, não continha GM3, c-Src nem Rho A, mas continha glicosilceramida, Ras, uma quantidade muito pequena de esfingomielina e uma quantidade muito grande de colesterol. A subfração de membrana enriquecida em GM3/c-Src foi caracterizada por (i) manutenção da adesão dependente de GM3 e (ii) suscetibilidade de ser ativada para transdução de sinal através de GM3. A fosforilação 32P de c-Src (Mr 60.000) juntamente com outros dois componentes (Mr 45.000 e 29.000) foi aumentada na fração ligada a pratos revestidos com asialo-GM2 (Gg3) ou com o anticorpo monoclonal anti-GM3 DH2, detectada por incubação com gamma-32PATP a 37 graus C por 5 minutos. A adesão dependente de GM3 das células B16 a pratos revestidos com Gg3 e a sinalização associada não foram reduzidas ou abolidas na presença de filipina ou nistatina, que são reagentes que ligam colesterol conhecidos por abolir a estrutura e função das caveolas. Células de melanoma B16 incubadas com filipina (0,16-0,3 microgramas/ml) ou com nistatina (25 microgramas/ml) por 30 minutos mostraram depleção de colesterol na fração de membrana insolúvel em detergente, mas ainda eram capazes de se ligar ao prato revestido com Gg3 e de realizar a sinalização associada. Assim, a subfração enriquecida em GM3, envolvida na adesão celular e capaz de enviar sinais através de GM3, representa um domínio de membrana distinguível da subfração contendo caveolina ou caveolas. Este microdomínio é denominado "domínio de sinalização de glicosfingolipídeos" ou "domínio de glicosinalização".