Identificação e Caracterização Funcional do Operão rfb de Lactococcus lactis, Necessário para a Biossíntese de dTDP-Rhamnose

dTDP-rhamnose é um precursor importante de polissacarídeos da parede celular e exopolissacarídeos (EPS) contendo rhamnose em Lactococcus lactis. Clonamos o operão rfbACBD de L. lactis MG1363, que compreende quatro genes envolvidos na biossíntese de dTDP-rhamnose. Quando expressos em Escherichia coli, os genes rfbACBD do lactococo puderam sustentar a produção heteróloga do antígeno O de Shigella flexneri, fornecendo evidências de sua funcionalidade. A superprodução das proteínas RfbAC em L. lactis resultou em níveis duplicados de dTDP-rhamnose, indicando que as atividades endógenas de RfbAC controlam a taxa de biossíntese intracelular de dTDP-rhamnose. No entanto, a superprodução de RfbAC não afetou os níveis de produção de B40-EPS contendo rhamnose. Um mutante condicional de RfbBD controlado por nisin não conseguiu crescer em meios que não continham o indutor nisin, indicando que os genes rfb desempenham um papel essencial em L. lactis. A limitação das atividades de RfbBD resultou na produção de EPS alteradas. O açúcar monomérico das EPS alteradas consistia em glicose, galactose e rhamnose em uma proporção molar de 1:0.3:0.2, que é claramente diferente da proporção no açúcar nativo. A análise biofísica revelou uma massa molecular quatro vezes maior e um raio de giramento duas vezes menor para as EPS alteradas, indicando que essas EPS são polímeros mais flexíveis com propriedades viscosificantes alteradas. Esta é a primeira indicação de que a atividade enzimática no nível do metabolismo central de carboidratos afeta a composição de EPS.