A109-10 筛选刺激成纤维细胞介导的Ⅰ型胶原降解的化合物

摘要 理由 肺纤维化的特征是细胞外基质（ECM）过度积累，主要是Ⅰ型胶原，导致肺部逐渐瘢痕化和功能丧失。许多抗纤维化化合物已被发现能减轻胶原沉积。然而，识别刺激Ⅰ型胶原降解的化合物（这一过程对纤维化清除是必要的）相对较少。为了识别此类化合物，我们开发了体外和体外实验来量化细胞外Ⅰ型胶原和Ⅰ型胶原降解产物。 方法 从自发性肺纤维化（IPF）患者获取的初代肺成纤维细胞（第1-3代，N=5）在含有2% FBS、2 ng/mL TGF-β和50 µg/mL抗坏血酸的DMEM/F12中培养72小时，以生成富含胶原的细胞衍生的ECM。随后在相同培养基中用测试化合物处理细胞24小时。使用Hoechst 33342进行核标记，通过自动显微镜量化细胞数。然后用含20 mM氢氧化铵和0.5% Triton X-100的溶液进行去细胞化处理。然后固定细胞衍生ECM，使用抗Ⅰ型胶原抗体染色并通过自动显微镜量化。通过测量细胞培养基中的I型胶原C末端肽（ICTP）来进一步评估Ⅰ型胶原降解。为研究基质金属蛋白酶-13（MMP-13）在胶原降解中的作用，我们使用选择性MMP-13抑制剂T26-C或用MMP-13 siRNA转染细胞。对胶原降解活性的体外验证通过测量来自IPF组织上叶和下叶的人精准切割肺片（PCLS，N=3）培养基中的I型胶原N端肽（NTX-I）来进行。 结果 测试了34种候选化合物（代谢、表观遗传和cAMP调节剂）在细胞衍生ECM中降低Ⅰ型胶原水平的能力。使用ICTP ELISA对六个命中和两个阳性对照进行了验证。总共发现五种化合物能够刺激胶原降解：EGCG（1 μM）、Nintedanib（0.25 μM）、SB431542（1 μM）和两种多巴胺受体激动剂A68930（10 μM）和Dihydrexidine（10 µM）。抑制或敲低MMP-13阻止了这五种化合物引起的胶原降解。在人类IPF PCLS中，确认了EGCG、Nintedanib和SB431542诱导的胶原降解，而Dihydrexidine则没有，且上叶的反应明显大于下叶。 结论 在培养的成纤维细胞和IPF PCLS中可以刺激胶原降解。这些系统将有助于揭示胶原降解的机制和调节因子，并可能为更好的纤维化解决疗法铺平道路。此摘要由NIH U01 HL152967资助。