Nutzung eines selbstspaltenden Peptids für maßgeschneiderte Kontrolle in der Nähe-Labeling-Proteomik

Protein-Protein-Interaktionen spielen eine wichtige biologische Rolle in jedem Aspekt der zellulären Homöostase und Funktion. Die Nähe-Labeling-Massenspektrometrie-basierte Proteomik überwindet Herausforderungen, die typischerweise mit anderen Methoden verbunden sind, und hat sich schnell zum aktuellen Stand der Technik auf diesem Gebiet entwickelt. Dennoch ist eine enge Kontrolle der enzymatischen Aktivität und der Expressionsniveaus beim Nähe-Labeling entscheidend, um Protein-Interaktoren genau zu identifizieren. Hier nutzen wir ein T2A selbstspaltendes Peptid und einen nicht-spaltenden Mutanten, um das Zielprotein im experimentellen und Kontroll-TurboID-Setup zu berücksichtigen. Um eine einfache und effiziente Plasmid-Assemblierung zu ermöglichen, haben wir ein Golden Gate-modulares Klonierungssystem entwickelt, um Plasmide für transiente Expression und stabile Integration zu generieren. Um unser T2A Split/link-Design zu betonen, haben wir es angewendet, um Proteininteraktionen des Glukokortikoidrezeptors und des Nukleokapsid- und nicht-strukturellen Proteins 7 (NSP7) des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) durch TurboID Nähe-Labeling zu identifizieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass unser T2A Split/link eine geeignete Kontrolle bietet, die auf zuvor festgelegten Kontrollanforderungen in diesem Bereich aufbaut.