Modulation des mikrohomologiebasierten End-zu-End-Verknüpfungswegs verringert große Deletionen und verbessert die homologe gerichtete Reparatur nach CRISPR-Cas9-verursachten DNA-Brüchen

Zusammenfassung Hintergrund Die CRISPR-Cas9-Genschneidetechnologie führt häufig zu unbeabsichtigten, großen genomischen Umstrukturierungen, die potenzielle Sicherheitsrisiken darstellen. Es gibt jedoch keine Methoden zur Minderung dieser Risiken. Ergebnisse Durch die Verwendung von Langstrecken-Einzelmolekül-Sequenzierung (IDMseq) fanden wir, dass der mikrohomologiebasierte End-zu-End-Verknüpfungsweg (MMEJ) eine herausragende Rolle bei Cas9-verursachten großen Deletionen (LDs) spielt. Wir zielten genetisch und/oder pharmakologisch auf MMEJ-assoziierte Gene ab und analysierten Cas9-induzierte LDs an mehreren Genloci mithilfe von Durchflusszytometrie und Langstrecken-Sequenzierung. Eine Reduzierung der POLQ-Spiegel oder -Aktivität verringert signifikant LDs, während eine Depletion oder Überexpression von RPA die LD-Häufigkeit erhöht bzw. verringert. Interessanterweise fördert die Inhibition von POLQ durch kleine Moleküle und die Bereitstellung von rekombinanten RPA-Proteinen auch dramatisch die homologe gerichtete Reparatur (HDR) an mehreren krankheitsrelevanten Genloci in menschlichen pluripotenten Stammzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen. Schlussfolgerungen Unsere Ergebnisse zeigen die kontrastierenden Rollen von RPA und POLQ bei Cas9-induzierten LD und HDR auf und deuten neue Strategien für sichereres und präziseres Genome Editing an.