Identifikation von Salmonella Enterica Serovar Typhi DNA durch loop-vermittelte isotherme Amplifikation mit fluoreszenter Detektion

Einleitung. Die Real-time PCR kann zusammen mit der loop-isothermen Amplifikationsmethode (LAMP) verwendet werden, die es ermöglicht, die Studie in 30–40 Minuten zur Diagnose von Typhus durchzuführen. Es wurden mehrere Varianten des LAMP-Assays zur Detektion von Salmonella enterica Serovar Typhi beschrieben. Die Studien berichten, dass relevante Primer an für Malaysia und China spezifischen Stämmen getestet wurden. Wir versuchten, die oben beschriebenen LAMP-Primers zur Identifizierung von S. Typhi-Stämmen, die spezifisch für die Russische Föderation sind, zu evaluieren und deren Sensitivität und Spezifität miteinander zu vergleichen. Materialien und Methoden. Eine vergleichende in silico-Analyse der Zielsequenzen wurde sowohl in der offenen NCBI-Datenbank als auch unter den genetischen Sequenzen von Sammlungstämmen am St. Petersburger Pasteur-Institut durchgeführt. Mehrere Primer-Sets zur LAMP-Amplifikation verschiedener S. Typhi-Genomregionen wurden getestet. Die getesteten Primer amplifizieren die folgenden Fragmente: SalTyp1 — Region des STY1607-Gens, SalTyp2 — Region des STY2879-Gens, SalTyp3 — Region des STBHUCCB₃8510-Gens des PapD-Chaperons. Ergebnisse. Die in silico-Analyse der LAMP-Primers zeigte, dass nur das SalTyp 3-Set eine strenge Spezifität für Salmonella enterica Serovar Typhi aufweist. Für die SalTyp 1 und SalTyp 2 wurde die Möglichkeit von falsch-positiven Reaktionen mit einigen E. coli-Stämmen aufgezeigt. Eine LAMP-Methode zur fluoreszenten DNA-Detektion des Auslösers von Typhus wurde gewählt. Der Assay basierte auf einem Marker-Gen namens STBHUCCB₃8510 und der Amplifikation mit sechs spezifischen Primern. Die Nachweisgrenze betrug 20 Kopien/Reaktion in Referenzplasmiden und die Reaktionszeit dauerte 35 Minuten. Die Spezifität der Methode wurde an DNA-Proben von 20 S. Typhi-Isolaten und 90 Stämmen anderer heterologer Bakterien aus 24 verschiedenen Arten getestet. Es wurden keine falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnisse identifiziert. Schlussfolgerung. Die entwickelte Methode kann in der klinischen Praxis zur labormäßigen Bestätigung der Diagnostik von Typhus als Teil der epidemiologischen Überwachung von Umweltobjekten sowie von Lebensmitteln verwendet werden.