Detaillierte Charakterisierung der Wechselwirkung von monoklonalen Antikörpern mit dem FcRn-Rezeptor mittels Affinitätsflüssigchromatographie, gekoppelt mit nativer Massenspektrometrie

Wir berichten über die Online-Kopplung der FcRn-Affinitätsflüssigchromatographie (LC) mit der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) unter nativen Bedingungen, um den Einfluss von Modifikationen auf die Wechselwirkung von rekombinanten mAbs mit dem immobilisierten FcRn-Rezeptordomäne zu untersuchen. Die Analysebedingungen wurden so gestaltet, dass sie die Anforderungen sowohl der Affinitäts-LC als auch der ESI-MS erfüllen. Die Zusammensetzung der mobilen Phase wurde optimiert, um die untersuchten Proteine unter nativen Bedingungen zu erhalten und scharfe pH-Änderungen zu ermöglichen, um die Wechselwirkung zwischen dem Fc-Domäne von IgGs und dem FcRn-Rezeptor angemessen zu simulieren. Die Komponenten der mobilen Phase mussten ausreichend flüchtig sein, um eine native MS-Analyse zu erreichen. MS-Daten zeigten die Erhaltung der pseudonativen Form von IgGs und ermöglichten die Identifizierung der separierten Varianten. Native FcRn-Affinitäts-LC-ESI-MS wurde bei einem therapeutischen mAb durchgeführt, der verschiedenen oxidativen Belastungen ausgesetzt war. Die nativen MS-Detektion wurde verwendet, um den Oxidationsgrad der Probe zu bestimmen. Eine geringere Retention wurde für oxidierte Varianten von mAbs im Vergleich zu ihren intakten Gegenstücken beobachtet, was auf eine verringerte Affinität zum Rezeptor hinweist. Diese Methodik erwies sich als geeignet, um posttranslationaler Modifikationen auf native Protein-Ebene zu identifizieren und zu quantifizieren, um ihren Einfluss auf die Bindung an den FcRn-Rezeptor zu korrelieren. Native FcRn-Affinitäts-LC-ESI-MS kann die Zeit erheblich reduzieren, die benötigt wird, um die biologische Relevanz der IgG-Mikroheterogenitäten zu bewerten, und liefert somit wertvolle Informationen für biopharmazeutische Forschung und Entwicklung.