Strukturelle Aufklärung und mechanismenbasierte Entwicklung einer promisken Esterase zur verbesserten Polyurethan-Depolymerisation

Polyurethan (PU) ist hochresistent gegenüber biologischer Abbaubarkeit, hauptsächlich aufgrund der intrinsischen Stabilität seiner Urethangruppen. Neben einer kleinen Anzahl von Amidase-Enzymen, die (Poly)urethanbindungen hydrolysieren, wurden auch mehrere promiske Esterasen gefunden, die die PU-Zersetzung katalysieren. In dieser Studie haben wir die ligandfreie Kristallstruktur von Aes72, einem Esterase-Enzym, das eine promiske hydrolytische Aktivität gegenüber Carbamat- und Amid-Bindungen zeigt, mit einer hohen Auflösung von 1,80 Å geklärt. Wir haben den katalytischen Mechanismus, der der Spaltung der Urethangruppe durch Aes72 zugrunde liegt, mittels multiskaliger Quantenmechanik/Molekulardynamik (QM/MM) Simulationen untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Reaktionsmechanismus aus vier konzertierten elementaren Schritten besteht, wobei der nukleophile Angriff (Schritt i) als geschwindigkeitsbestimmender Schritt identifiziert wurde. Die anschließende strukturelle Entwicklung von Aes72 ergab mehrere verbesserte Einzelmutanten, was letztendlich zu einem überlegenen Doppelmutanten, F276A/L141I, führte. Diese Variante zeigte eine etwa zwei-fache Erhöhung der katalytischen Effizienz gegenüber der Hydrolyse von bis(4-hydroxybutyl)(methylenbis(4,1-phenylenglycol))dicarbamat (BMC) und eine signifikant verbesserte Zersetzungsleistung bei zwei verschiedenen polyether-basierten PU-Materialien im Vergleich zum Wildtyp-Enzym. Unsere Ergebnisse liefern wesentliche mechanistische Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung der promisken Esterase Aes72 in der PU-Zersetzung und demonstrieren ihre potenzielle Anwendbarkeit im biobasierten Kunststoffrecycling.