Ingenieurwesen des Bakteriophagen T4 Genoms unter Verwendung von CRISPR-Cas9

Bakteriophagen stellen wahrscheinlich die größte Biomasse auf der Erde dar. Dennoch sind nur sehr wenige Phagen-Genome gut charakterisiert, wobei das Schwanzphagen-Genome T4 eines davon ist. Selbst im T4 blieb ein großer Teil des Genoms uncharakterisiert. Die klassischen genetischen Strategien sind mühsam, zusätzlich kompliziert durch genomische Modifikationen wie Cytosin-Hydroxymethylierung und Glucosylierung, die T4-DNA gegen die meisten Restriktionsendonukleasen resistent machen. Hier berichten wir unter Verwendung des Typ-II CRISPR-Cas9-Systems über die Bearbeitung sowohl des modifizierten (ghm-Cytosin) als auch des unmodifizierten (Cytosin) T4-Genoms. Das modifizierte Genom ist jedoch weniger anfällig für den Cas9-Nuklease-Angriff im Vergleich zum unmodifizierten Genom. Die Effizienz der Einschränkung von modifizierten Phageninfektionen variierte stark in einem spacerabhängigen Muster, was einige der vorherigen widersprüchlichen Ergebnisse erklärt. Wir entwickelten eine Genom-Bearbeitungsstrategie, indem wir in E. coli ein CRISPR-Cas9-Plasmid und ein Donor-Plasmid mit der gewünschten Mutation(en) codeliverten. Einfache und multiple Punktmutationen, Insertionen und Deletionen wurden sowohl in modifizierte als auch in unmodifizierte Genome eingeführt. Bereits 50-bp lange homologe flankierende Arme waren ausreichend, um Rekombinanten zu erzeugen, die unter dem Druck der CRISPR-Cas9-Nuklease selektiert werden konnten. Eine 294-bp-Deletion im RNA-Ligase-Gen rnlB erzeugte lebensfähige Plaques und demonstrierte die Nützlichkeit dieser Bearbeitungsstrategie zur Bestimmung der Wesentlichkeit eines bestimmten Gens. Diese Ergebnisse bieten die erste Demonstration der phage T4 Genom-Bearbeitung, die auf andere Phagen-Genome in der Natur ausgeweitet werden könnte, um nützliche Rekombinanten für Anwendungen der Phagentherapie zu schaffen.