Funktionelle Analyse von Alkanhydroxylasen aus gramnegativen und grampositiven Bakterien

Wir haben Homologe der Alkanhydroxylase von Pseudomonas putida GPo1 aus Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas fluorescens CHA0, Alcanivorax borkumensis AP1, Mycobacterium tuberculosis H37Rv und Prauserella rugosa NRRL B-2295 kloniert. Sequenzvergleiche zeigen, dass der Grad der Proteinsequenzidentität zwischen den Homologen bis zu 35 % niedrig ist und dass die Alkanhydroxylasen von Pseudomonas untereinander ebenso entfernt verwandt sind wie mit den übrigen Alkanhydroxylasen. Basierend auf der Beobachtung, dass Rubredoxin, eine Elektronentransferkomponente des GPo1-Alkanhydroxylase-Systems, durch Rubredoxine aus anderen Alkanhydroxylase-Systemen ersetzt werden kann, haben wir drei rekombinante Wirtsstämme für die funktionelle Analyse der neuartigen Alkanhydroxylase-Gene entwickelt. Zwei Wirte, Escherichia coli GEc137 und P. putida GPo12, wurden mit pGEc47 Delta B ausgestattet, das für alle Proteine kodiert, die für das Wachstum auf mittelkettigen Alkanen (C(6) bis C(12)) notwendig sind, mit Ausnahme einer funktionellen Alkanhydroxylase. Der dritte Wirt war ein alkB-Knockout-Derivat von P. fluorescens CHA0, das nicht mehr auf C(12)- bis C(16)-Alkanen wachsen kann. Alle Alkanhydroxylase-Homologe, mit Ausnahme des AlkM von Acinetobacter sp. ADP1, ermöglichten mindestens einem der drei Wirte das Wachstum auf n-Alkanen.