Vergleich verschiedener Probenvorbereitungsmethoden für die PCR-Diagnose von viszeraler Leishmaniasis unter Verwendung von peripheren Blutproben

Wir haben verschiedene Probenvorbereitungsmethoden für die PCR-Diagnose der viszeralen Leishmaniasis (VL) unter Verwendung von peripheren Blutproben verglichen und den Einfluss dieser Protokolle auf die Sensitivität getestet. Vier Methoden zur Lyse-DNA-Extraktion wurden mit zwei Arten von Blutproben verwendet: Vollblut (WB) und Leukozytenkonzentrat (BC). Die Vergleiche wurden zunächst mit angereicherten Proben bei verschiedenen Parasitenkonzentrationen durchgeführt. Bei hohen Konzentrationen (> oder = 1.000 Parasiten/ml) gab es keine signifikanten Unterschiede in der PCR-Sensitivität zwischen den getesteten Methoden. Bei Konzentrationen von < oder = 100 Parasiten/ml erwiesen sich Proteinase K (PK)-basierte Methoden als deutlich überlegen gegenüber guanidin-EDTA-basierten Methoden. Zudem wurde ein 10-facher Anstieg der Sensitivität für BC im Vergleich zu WB festgestellt. Somit wurde die beste Sensitivität mit BC erzielt, das mit PK-basierten Methoden präpariert wurde. Mit dieser Kombination konnte die PCR zuverlässig 10 Parasiten/ml nachweisen, zeigte jedoch Inkonsistenzen, wenn die Probe 1 Parasite/ml Blut enthielt. Die Methoden, die die höchsten Sensitivitäten lieferten, wurden an sieben Hunden und vier menschlichen VL-Patienten evaluiert. Wiederum ergab die Verwendung von BC, das mit PK-basierten Methoden präpariert wurde, die besten Ergebnisse. Die Optimierung jedes Schrittes des Tests (Probenvorbereitung, DNA-Extraktion und PCR-Bedingungen) ergab ein hochsensibles Werkzeug zur Diagnose von VL mit Patientenblut, wodurch invasivere diagnostische Verfahren vermieden und die Erkennung niedriger Parasitenzahlen während der posttherapeutischen Nachverfolgung ermöglicht wurde.