Das Tol2kit: Ein Multisite-Gateway-basiertes Konstruktionsequipment für Tol2-Transposon-Transgenese-Konstrukte

Transgenese ist ein wichtiges Werkzeug zur Bewertung der Genfunktion. Bei Zebrafischen hat die Transgenese unter drei Problemen gelitten: der Aufwand für den Bau komplexer Expressionskonstrukte mittels konventioneller Subklonierung; die geringe Effizienz der Transgenese, die zu Mosaikbildung bei transienten Transgenikern und seltener Keimbahn-Inkorporation führt; und die Schwierigkeit, Keimbahn-Integrationen zu identifizieren, es sei denn, es wird ein fluoreszierendes Marker-Transgen verwendet. Das Tol2kit-System verwendet die klonbasierte site-spezifische Rekombination (Multisite-Gateway-Technologie), um eine schnelle, modulare Assemblierung von Promotor-codierenden Sequenz-3'-Tag-Konstrukten in einem Tol2-Transposon-Rückgrat zu ermöglichen. Es umfasst einen Zielvektor mit einem cmlc2:EGFP (enhanced green fluorescent protein) Transgenese-Marker und eine Vielzahl von weit nützlichen Entry-Clonen, einschließlich hsp70- und beta-aktin-Promotoren; zyto-plasmatische, nukleäre und membranlokalisierte fluoreszierende Proteine; sowie interne Ribosomen-Eintrittssequenz-gesteuerte EGFP-Kassetten für bicistronische Expression. Das Tol2kit erleichtert die Zebrafisch-Transgenese erheblich, vereinfacht die Weitergabe von Klonen und ermöglicht großangelegte Projekte zur Prüfung der Funktionen von Bibliotheken regulatorischer oder codierender Sequenzen.