Ein unnatürliches Basenpaar-System zur effizienten PCR-Amplifikation und Funktionalisierung von DNA-Molekülen

Zur Erweiterung des genetischen Alphabets präsentieren wir ein unnatürliches Basenpaar-System für eine effiziente PCR-Amplifikation, das die standortspezifische Einfügung zusätzlicher funktioneller Komponenten in DNA ermöglicht. Dieses System kann auf herkömmliche PCR-Protokolle angewendet werden, die DNA-Vorlagen mit unnatürlichen Basen, natürlichen und unnatürlichen Basentrifosophaten sowie einer 3'-->5' exonuklease-fähigen DNA-Polymerase verwenden. Für eine hochtreue und effiziente PCR-Amplifikation, die unnatürliche Basenpaarung umfasst, identifizierten wir die natürlichen Basensequenzen rund um die unnatürlichen Basen in DNA-Vorlagen durch eine in vitro-Selektionstechnik, unter Verwendung einer DNA-Bibliothek, die die unnatürliche Base enthält. Das System erleichtert die standortspezifische Einfügung einer Vielzahl modifizierter unnatürlicher Basen, verknüpft mit funktionellen Gruppen von Interesse, in amplifizierte DNA. DNA-Fragmenten (0,15 amol), die das unnatürliche Basenpaar enthalten, können durch 30 Zyklen PCR um den Faktor 10(7) amplifiziert werden, mit <1 % Gesamtmutationsrate des unnatürlichen Basenpaarstandorts. Mit dem System demonstrierten wir eine effiziente PCR-Amplifikation und Funktionalisierung von DNA-Fragmenten für die extrem sensitive Detektion von Ziel-DNA-Molekülen im Zeptomol-Maßstab aus Mischungen mit überschüssigen Mengen (pmol-Maßstab) fremder DNA-Spezies. Dieses unnatürliche Basenpaar-System wird auf eine breite Palette von DNA/RNA-basierten Technologien anwendbar sein.