Mutanten des Cytochrom P450 Reduktase, die entweder Gly-141 oder Gly-143 fehlen, destabilisieren sein FMN Semiquinon

NADPH-Cytochrom P450 Oxidoreduktase überträgt Elektronen von NADPH auf Cytochrom P450s über sein FAD und FMN. Um die biochemischen und strukturellen Grundlagen des Elektronentransfers von FMN-Hydroquinon zu seinen Partnern zu verstehen, wurden drei Deletionsmutanten in einer konservierten Schleife nahe dem FMN charakterisiert. Der Vergleich von oxidierten und reduzierten Wildtyp- und Mutantenstrukturen zeigt, dass die Basis für die Luftstabilität des neutralen blauen Semiquinons die Protonierung des Flavin N5 und eine starke H-Bond-Bildung mit dem Gly-141-Ketogruppe ist. Das ΔGly-143-Protein hatte eine moderat verringerte Aktivität mit Cytochrom P450 und Cytochrom c. Es bildete eine flexible Schleife, die transient mit dem Flavin N5 interagiert, was zur Erzeugung sowohl eines instabilen neutralen blauen Semiquinons als auch von Hydroquinon führt. Die ΔGly-141- und ΔG141/E142N-Mutanten waren inaktiv mit Cytochrom P450, aber vollständig aktiv bei der Reduktion von Cytochrom c. Bei den ΔGly-141-Mutanten bildet das Rückgrat-Amyd von Glu/Asn-142 eine H-Bindung zu N5 des oxidierten Flavins, was zur Bildung eines instabilen roten anionischen Semiquinons mit einem negativiveren Potential als das Hydroquinon führt. Das Semiquinon von ΔG141/E142N war etwas stabiler als das von ΔGly-141, was mit seiner kristallographisch nachgewiesenen stabileren Schleife übereinstimmt. Dennoch waren beide ΔGly-141 roten Semiquinone weniger stabil als die der entsprechenden Schleife im Cytochrom P450 BM3 und dem neuronalen NOS-Mutanten (ΔGly-810). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die katalytische Aktivität der Cytochrom P450 Oxidoreduktase eine Funktion der Länge, Sequenz und Flexibilität der 140er Schleife ist und illustrieren die raffinierte Vielfalt biochemischer Mechanismen, die bei der Feineinstellung ihrer Redox-Eigenschaften und Funktionen verwendet werden.