Verbesserung der trans-Cleavage-Aktivität von CRISPR/Cas12a unter Verwendung von Haarnadel-DNA-Reportern

Die RNA-programmierte unspezifische (trans) Nukleaseaktivität von CRISPR-Cas Typ V und VI Systemen hat eine neue Ära im Bereich der nucleinsäurebasierten Detektion eröffnet. Hier berichten wir über die Verbesserung der trans-Cleavage-Aktivität von Cas12a-Enzymen unter Verwendung von Haarnadel-DNA-Sequenzen als FRET-basierte Reporter. Wir entdecken eine schnellere Rate der trans-Cleavage-Aktivität von Cas12a aufgrund seiner verbesserten Affinität (Km) zu Haarnadel-DNA-Strukturen und geben mechanistische Einblicke in unsere Ergebnisse durch Molekulardynamik-Simulationen. Mit Haarnadel-DNA-Sonden verbessern wir signifikant die FRET-basierte Signalübertragung im Vergleich zu den weit verbreiteten linearen einzelsträngigen DNA-Reportern. Unsere Signalübertragung ermöglicht eine schnellere Detektion von klinisch relevanten doppelsträngigen DNA-Zielen mit verbesserter Sensitivität und Spezifität, sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit eines vorgelagerten Vorverstärkungsschrittes.