Kleinmaßstäbige Analyse von O-gebundenen Oligosacchariden aus Glykoproteinen und Mucinen, die durch Gel-Elektrophorese getrennt wurden

Eine Technik mit Subpikomolarsensitivität wurde entwickelt, um O-gebundene Oligosaccharide zu analysieren, die aus Glykoproteinen, die durch Gel-Elektrophorese getrennt wurden, freigesetzt wurden. Das Protokoll umfasst Gel-Elektrophorese, Elektroblotting auf eine Poly-(Vinylidenfluorid)-Membran, reduktive Beta-Eliminierung und Analyse der freigesetzten Oligosaccharide durch Flüssigchromatographie gekoppelt mit negativer Ionen-Elektrospray-Massenspektrometrie. Es wurde auch festgestellt, dass N-gebundene Oligosaccharide unter denselben Bedingungen recycelt werden konnten, sowohl in Form freier Oligosaccharide als auch als unterschiedliche Glycopeptide, die aus der reduktiven Spaltung des Proteinrückgrats entstanden sind, was einige Informationen zur standortspezifischen Glykosylierung liefert. Die Methode wurde verwendet, um zu demonstrieren, dass der Unterschied zwischen den Isoformen des humanen Alpha-2HS-Glykoproteins, die durch 2D-Gel-Elektrophorese getrennt wurden, teilweise auf die Sialylierung sowohl der O-gebundenen als auch der N-gebundenen Oligosaccharide zurückzuführen war. Es wurde auch gezeigt, dass sowohl saure als auch neutrale Oligosaccharide gleichzeitig aus hochmolekularen (200.000-5.000.000 Da) hochglykosylierte Mucin-Glykoproteine, die aus dem Dünndarm und dem Speichel entnommen wurden, zurückgewonnen und analysiert werden konnten, und die durch Natriumdodecylsulfat-Agarose/polyacrylamid-composite-Gele getrennt wurden. Massenspektrometrische Daten lieferten nicht nur Informationen über die Massendispersität der heterogenen Mischungen von Oligosacchariden aus M - xH(x-) Ionen, sondern auch Informationen über die isomerische Heterogenität der Oligosaccharide durch ihre Auftrennung mittels poröser graphitisierter Kohlenstoffchromatographie. Tandem-Massenspektrometrie wurde als Technik untersucht, um zwischen Oligosaccharid-Isomeren mit unterschiedlichen Sequenzen sowie zwischen Oligosacchariden mit derselben Sequenz, jedoch unterschiedlichen Bindungskonfigurationen, zu unterscheiden.