Engineering des größten RNA-Virusgenoms als infektiendes bakterielles Kunstchromosom

Der Bau von cDNA-Clonen, die großformatige RNA-Moleküle biologischen Interesses kodieren, wie z. B. Coronavirus-Genome, die zu den größten bekannten reifen RNA-Molekülen in der Biologie gehören, wurde durch die Instabilität dieser cDNAs in Bakterien behindert. Hier zeigen wir, dass die Anwendung von zwei Strategien, das Klonen der cDNAs in ein bakterielles Kunstchromosom und die nukleare Expression von RNAs, die typischerweise im Zytoplasma produziert werden, nützlich für die Ingenieurkunst großer RNA-Moleküle ist. Eine cDNA, die ein infektiöses Coronavirus-RNA-Genom kodiert, wurde als bakterielles Kunstchromosom kloniert. Das gerettete Coronavirus bewahrte alle genetischen Marker, die im Verlauf der Sequenz eingeführt wurden, und zeigte ein typisches mRNA-Muster sowie die antigenen Eigenschaften, die für das synthetische Virus zu erwarten sind. Die cDNA wurde im Zellkern transkribiert, und die RNA wurde ins Zytoplasma transloziert. Interessanterweise hatte das wiederhergestellte Virus im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie das ursprüngliche, und es wurde keine Splicing beobachtet. Die cDNA stammte von einem abgeschwächten Isolat, das ausschließlich im Atemweg von Schweinen repliziert. Während der Ingenieurkunst der infektiösen cDNA wurde das Spike-Gen des Virus durch das Spike-Gen eines enteralen Isolats ersetzt. Das synthetische Virus replizierte reichlich im enteralen Trakt und war vollständig virulent, was zeigt, dass das Tropismus und die Virulenz des wiederhergestellten Coronaviruses modifiziert werden können. Diese Demonstration eröffnet die Möglichkeit, diese infektiöse cDNA als Vektor für die Impfstoffentwicklung bei menschlichen, porzinen, canine und feline Arten, die anfällig für Gruppe 1 Coronaviren sind, zu verwenden.