Korrektur von Mutationen im Cystische Fibrose Transmembranleitungsregulator durch zielgerichtete RNA-Bearbeitung

Adenosindeaminasen, die auf RNA wirken, sind eine konservierte Familie von Enzymen, die einen natürlichen Prozess der zielgerichteten Mutagenese katalysieren. Biochemisch wandeln sie Adenosin in Inosin um, ein Nukleotid, das während der Translation als Guanosin gelesen wird; wenn also eine Bearbeitung in mRNAs erfolgt, können Kodons neu kodiert werden und die Änderungen können die Proteinfunktion verändern. Indem wir die endogenen Zielstrukturen der menschlichen Adenosindeaminase, die auf RNA 2 wirkt, entfernen und durch ein Antisense-RNA-Oligonukleotid ersetzen, haben wir ein rekombinantes Enzym entwickelt, das überall entlang des RNA-Registers bearbeitet werden kann. Hier zeigen wir, dass dieses Enzym effizient und selektiv ein einzelnes Adenosin bearbeiten kann. Als Proof of Principle in vitro korrigieren wir ein vorzeitiges Stoppkodon in mRNAs, die den Cystische Fibrose Transmembranleitungsregulator-Anionenkanal kodieren. In Xenopus-Oozyten zeigen wir, dass eine genetisch codierte Version unseres Editase das Cystische Fibrose Transmembranleitungsregulator-mRNA korrigieren, das vollständige Protein wiederherstellen und funktionelle Chloridströme über die Plasmamembran reetablieren kann. Schließlich zeigen wir in einer menschlichen Zelllinie, dass eine genetisch codierte Version unserer Editase und der Leit-RNA eine nicht funktionale Version des verbesserten grünen fluoreszierenden Proteins korrigieren kann, die ein vorzeitiges Stoppkodon enthält. Diese Technologie sollte leistungsstarke Ansätze zur Korrektur einer Vielzahl genetischer Mutationen und zur Feinabstimmung der Proteinfunktion durch gezielte Nukleotid-Deaminierung anstoßen.