Minimale genetisch kodierte Markierungen für die Fluoreszenzproteinmarkierung in lebenden Neuronen

Moderne Lichtmikroskopie, einschließlich Superauflösetechiken, hat zu einer Nachfrage nach kleinen Markierungstags geführt, die den Fluorophor näher an das Ziel bringen. Diese Herausforderung kann durch die Markierung von unnatürlichen Aminosäuren (UAAs) mit bioorthogonaler Click-Chemie angegangen werden. Die minimale Größe der UAA und die Möglichkeit, die Fluorophore mit einer einzigen Restgenauigkeit direkt an das Protein von Interesse in lebenden Zellen zu koppeln, machen die Click-Markierung einzigartig. Hier stellen wir die Click-Markierung in lebenden primären Neuronen her und nutzen sie für fixierte Zellen, lebende Zellen, Dual-Color-Pulse-Chase und Superauflösungmikroskopie des Neurofilament-Leichtkette (NFL). Wir zeigen auch, dass die Click-Markierung mit CRISPR/Cas9-Genomtechnik zum Tagging endogenen NFL kombiniert werden kann. Aufgrund ihrer vielseitigen Natur und der Kompatibilität mit fortgeschrittenen multicolor Mikroskopietechniken erwarten wir, dass die Click-Markierung zu neuartigen Entdeckungen im Bereich der Neurobiologie beitragen wird.