Eine universelle Methode zur Herstellung von in vitro Transkripten mit homogenen 3'-Enden

Es wird eine Methode beschrieben, die es ermöglicht, einen allgemeinen Nachteil von in vitro Transkriptionsassays zu überwinden: RNA-Polymerasen neigen dazu, zusätzliche Nukleotide am 3'-Ende der RNA hinzuzufügen, die nicht im linearisierten DNA-Template kodiert sind. Darüber hinaus zeigen diese Polymerasen eine erhebliche Rate an vorzeitiger Terminierung in der Nähe des 3'-Endes der RNA. Diese Merkmale führen zu einem verringerten Ertrag an vollständigen Transkripten und machen es oft schwierig, das korrekt transkribierte vollständige RNA zu bestimmen und zu isolieren. Das Hammerkopfribozyms wird häufig in cis verwendet, um diese zusätzlichen Nukleotide abzuschneiden. Die Anforderungen an die upstream Sequenz dieses Ribozyms schränken jedoch seine allgemeine Verwendbarkeit ein. Im Gegensatz dazu hat das Hepatitis-Delta-Virus-Ribozyms keine solchen Anforderungen und kann daher auf jede RNA-Sequenz in cis angewendet werden. Aufgrund der katalytischen Aktivität des Ribozyms wird das gewünschte Transkript als RNA-Molekül mit einem homogenen 3'-Ende freigesetzt. Die resultierende 2',3'-Cyclo-Phosphat-Gruppe der freigesetzten RNA kann leicht und effizient durch die Behandlung mit T4-Polynukleotid-Kinase entfernt werden. Die präsentierte Methode kann für praktisch jede zu transkribierende Sequenz angewendet werden und ist daher anderen Ribozyms-Strategien überlegen, was mögliche Anwendungen in jedem Bereich nahelegt, in dem Transkripte mit homogenen 3'-Enden erforderlich sind.