Induzierbare Expression großer gRNA-Arrays für multiplexe CRISPRai-Anwendungen

CRISPR-Genaktivierung und -inhibition (CRISPRai) hat sich zu einem leistungsstarken synthetischen Werkzeug entwickelt, um die Expression von nativen Genen für grundlegende Studien, zelluläre Reprogrammierung und metabolische Engineering zu beeinflussen. Hier entwickeln wir eine Methode für nahezu undurchlässige, induzierte Expression eines polycistronischen Arrays, das bis zu 24 gRNAs aus zwei orthogonalen CRISPR/Cas-Systemen enthält, um die Multiplex-Kapazität von CRISPRai und die Flexibilität der Zielgene zu erhöhen. Um eine starke Induzierbarkeit zu erreichen, schaffen wir eine Technologie, um die gRNA-Expression innerhalb des Arrays in Abwesenheit des Induktors zum Schweigen zu bringen, da wir festgestellt haben, dass lange gRNA-Arrays für CRISPRai sich sogar ohne Promotor selbst exprimieren können. Mit dieser Methode erstellen wir ein hochgradig abgestimmtes und benutzerfreundliches CRISPRai-Toolkit in der industrierelevanten Hefe, Saccharomyces cerevisiae, wobei wir das erste System etablieren, das gleichzeitige Aktivierung und Repression, große Multiplex-Kapazität und Induzierbarkeit kombiniert. Wir demonstrieren dieses Toolkit, indem wir 11 Gene im zentralen Stoffwechsel in einer einzigen Transformation anvisieren und einen 45-fachen Anstieg der Bernsteinsäure erreichen, der auf präzise induzierbare Weise kontrolliert werden konnte. Unsere Methode bietet einen hochwirksamen Weg zur Regulierung von Genen und zur Umgestaltung des Stoffwechsels in Hefen, mit Prinzipien des gRNA-Array-Baus und der Induzierbarkeit, die auf andere Chassis-Organismen ausgeweitet werden sollten.