Bile-Säure-Hydrolase von Bifidobacterium longum — Biochemische und genetische Charakterisierung

Eine Bile-Säure-Hydrolase (BSH) wurde aus Bifidobacterium longum SBT2928 isoliert, gereinigt und charakterisiert. Darüber hinaus beschreiben wir erstmals das Klonen und die Analyse des Gens, das BSH (bsh) in einem Mitglied der Gattung Bifidobacterium kodiert. Das Enzym hat ein natives Molekulargewicht von 125.000 bis 130.000 und ein Subunit-Molekulargewicht von 35.024, bestimmt aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz, was darauf hinweist, dass das Enzym ein Tetramer ist. Das pH-Optimum von B. longum BSH liegt zwischen 5 und 7, und das Temperatur-Optimum beträgt 40 Grad C. Das Enzym wird stark durch Thiol-Enzym-Inhibitoren inhibiert, was darauf hindeutet, dass eine Cys-Rest wahrscheinlich an der katalytischen Reaktion beteiligt ist. Die BSH von B. longum kann alle sechs Haupt-Bile-Säuren des Menschen und mindestens zwei Tier-Bile-Säuren hydrolysieren. Eine leichte Präferenz für glycin-konjugierte Bile-Säuren wurde basierend auf der Spezifität und den K(m)-Werten festgestellt. Die Nukleotidsequenz von bsh wurde bestimmt und für Homologiestudien, Transkriptanalyse und Konstruktion und Analyse verschiedener Mutanten verwendet. Die Homologitätsniveaus mit BSH anderer Bakterien und mit Penicillin V-Acylase (PVA) von Bacillus sphaericus waren hoch. Auf der Grundlage der Ähnlichkeit von BSH und PVA, deren Kristallstruktur aufgeklärt wurde, kann BSH als N-terminale nukleophile Hydrolase klassifiziert werden, wobei Cys die N-terminale Aminosäure ist. Diese Klassifikation wurde durch die Tatsache bestätigt, dass ein Cys1Ala-Austausch durch gezielte Mutagenese zu einem inaktiven Protein führte. Experimente zur reversen Transkriptions-PCR zeigten, dass bsh Teil eines Operons ist, das mindestens zwei Gene, bsh und glnE (GlnE ist Glutamin-Synthetase-Adenylyltransferase), enthält. Zwei UV-induzierte BSH-negative Mutanten und eine spontane BSH-negative Mutante wurden aus B. longum SBT2928-Kulturen isoliert und charakterisiert. Diese Mutanten hatten Punktmutationen, die bsh durch vorzeitige Terminierung, Leseraster oder Aminosäureaustausch inaktivierten.