Hochgradig multiplexierte quantitative PCR-basierte Plattform zur Bewertung der Immunantworten von Hühnern

Um dem Bedarf an empfindlichen Hochdurchsatz-Assays zur Analyse der angeborenen und adaptiven Immunantworten bei Vögeln gerecht zu werden, haben wir ein hochgradig multiplexiertes qPCR 96.96 Fluidigm Dynamic Array entwickelt und validiert, um die Transkription immunrelevanter Gene bei Hühnern zu analysieren. Dieses mikrofluidische System ermöglicht die gleichzeitige Analyse der Expression von 96 Transkripten in 96 Proben in 6 Nanoliter-Reaktionen, und die 9.216 Reaktionen sind sofort zur Interpretation bereit. Ein Panel von 89 Genen wurde aus einer RNA-seq-Analyse der transkriptionalen Antwort von Hühner-Makrophagen, dendritischen Zellen und heterophilen Granulozyten auf Agonisten der angeborenen Immunität sowie aus veröffentlichten Transkriptomdaten ausgewählt. Die Assays wurden durch Amplicon-Sequenzierung und Schmelzkurvenanalyse als hochspezifisch bestätigt, und die Schritte der rückwärtsgerichteten Transkription und Vorverstärkung wurden optimiert. Das Array wurde auf RNA verschiedener Gewebe aus einer kommerziellen Linie von Broilern angewendet, die auf zwei verschiedenen Biosecurity-Ebenen gehalten wurden. Darmassoziierte lymphoide Gewebe, Bursa, Milz und periphere Blutleukozyten wurden isoliert, und die Transkriptspiegel für immunrelevante Gene wurden definiert. Die Ergebnisse identifizierten Blutkörperchen als potenziell zuverlässigen Indikator für Immunantworten unter allen getesteten Geweben mit der höchsten Anzahl von Genen, die signifikant unterschiedlich transkribiert waren, zwischen Vögeln, die unter verschiedenen Biosecurity-Ebenen gehalten wurden. Die konventionelle qPCR-Analyse von drei verschiedenen transkribierten Genen bestätigte die Ergebnisse aus dem multiplexen qPCR-Array. Eine hochgradig multiplexierte qPCR-basierte Plattform zur Bewertung der Immunantworten von Hühnern wurde optimiert und validiert, indem Proben von kommerziellen Hühnern verwendet wurden. Neben Anwendungen in selektiven Zuchtprogrammen könnte das Array verwendet werden, um das komplexe Zusammenspiel zwischen dem avianen Immunsystem und Krankheitserregern durch die Einbeziehung pathogen-spezifischer Sonden zu analysieren, um Impfantworten zu untersuchen und als prädiktives Werkzeug für die Immunrobustheit zu fungieren.