Key points are not available for this paper at this time.
Wir haben die Methodik verbessert und die Zeit für die genaue Assemblierung von 5- bis 6-kb-DNA-Segmenten aus synthetischen Oligonukleotiden dramatisch verkürzt. Als Test dieser Methodik haben wir Bedingungen für die schnelle (14 Tage) Assemblierung des vollständigen infektiösen Genoms des Bakteriophagen X174 (5386 bp) aus einem einzelnen Pool chemisch synthetisierter Oligonukleotide festgelegt. Das Verfahren umfasst drei zentrale Schritte: (i) Gelreinigung der gepoolten Oligonukleotide, um die Kontamination mit Molekülen falscher Kettenlänge zu reduzieren, (ii) Ligation der Oligonukleotide unter strengen Annealbedingungen (55 Grad C), um gegen das Annealen von Molekülen mit falschen Sequenzen auszuwählen, und (iii) Assemblierung der Ligationserzeugnisse zu vollständigen Genomen durch Polymerase-Zyklus-Assemblierung, eine nicht-exponentielle Reaktion, bei der jedes terminale Oligonukleotid nur einmal verlängert werden kann, um ein vollständiges Molekül zu erzeugen. Bei der Gelanalyse des Produkts der Polymerase-Zyklus-Assemblierung beobachteten wir ein diskrates Band vollständiger Assemblierungen, ohne jegliche PCR-Amplifikation. Anschließend wurde PCR-Amplifikation verwendet, um größere Mengen reiner vollständiger Genome für die Zirkularisation und Infektionsmessungen zu erhalten. Die synthetische DNA hatte eine geringere Infektiosität als natürliche DNA, was ungefähr einen tödlichen Fehler pro 500 bp anzeigte. Dennoch wurden vollständig infektiöse X174-Virionen nach Elektroporation in Escherichia coli zurückgewonnen. Die Sequenzanalyse mehrerer infektiöser Isolate bestätigte die Genauigkeit dieser synthetischen Genome. Ein solches Isolat hatte genau die beabsichtigte Sequenz. Wir schlagen vor, größere Genome durch Zusammenfügen separat assemblierter 5- bis 6-kb-Segmente zu erstellen; etwa 60 solcher Segmente wären für ein minimales zellulares Genom erforderlich.
Smith et al. (Tue,) haben diese Frage untersucht.