Absolute mRNA-Quantifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Ein neuer Ansatz durch einen PCR-unterstützten Transkript-Titrationstest (PATTY)

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird als Teil eines neuen Ansatzes zur absoluten Quantifizierung von mRNA verwendet. Wir beschreiben einen PCR-unterstützten Transkript-Titrationstest (PATTY), der auf der Co-Amplifikation eines in vitro erzeugten Transkripts basiert, das sich durch einen einzelnen Basenaustausch vom Ziel-mRNA unterscheidet. Identische Teile einer Gesamt-RNA-Probe werden mit unterschiedlichen Mengen dieses mutierten Standard-RNA "gespickt", in cDNA umgewandelt und durch PCR amplifiziert. Da der Basenaustausch eine neuartige Restriktionsendonuklease-Stelle schafft, kann das Verhältnis der co-amplifizierten DNA, die von der Ziel-mRNA abgeleitet ist, zu der amplifizierten DNA, die von der Standard-RNA abgeleitet ist, nach der Restriktionsendonuklease-Verdauung und Trennung durch Gelelektrophorese bestimmt werden. Diese Methode liefert innerhalb von 24 Stunden genaue Ergebnisse und ist insbesondere nützlich für die Quantifizierung entweder von mRNA mit geringer Abundanz oder von reichlicherer mRNA, die in sehr kleinen Mengen an Gesamt-RNA vorhanden ist. Die mRNA mit geringer Abundanz, die 4-Coumarat:CoA-Ligase (4CL) in kultivierten Kartoffelzellen (Solanum tuberosum L.) kodiert, wurde in einer Fallstudie gemessen. Etwa 100 Moleküle pro Test konnten mit der neuen Methode genau nachgewiesen werden.