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Hier berichten wir über die strukturelle Charakterisierung des Produkts, das aus der Reaktion zwischen Hydroethidin (HE) und Superoxid (O₂^{-}) entsteht. Durch den Einsatz von Massenspektralanalyse und NMR-Techniken wurde die chemische Struktur dieses Produkts als 2-Hydroxyethidium (2-OH-E +) bestimmt. Mit einem authentischen Standard entwickelten wir einen HPLC-Ansatz, um das Reaktionsprodukt von HE und O₂^{-}, das in bovinen aortalen Endothelzellen nach Behandlung mit Menadion oder Antimycin A zur Induktion intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies gebildet wurde, nachzuweisen und zu quantifizieren. Gleichzeitig verwendeten wir einen Spinfallen, 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxid (BMPO), um die Struktur der gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies zu erkennen und zu identifizieren. BMPO fing das O₂^{-} ein, das extrazellulär entstand, und wurde während der Anwendung der EPR-Technik als BMPO-OH-Addukt nachgewiesen. BMPO, das zellpermeabel ist, inhibitierte die intrazelluläre Bildung von 2-OH-E +. Allerdings wurde das intrazelluläre BMPO-Spinaddukt nicht nachgewiesen. Die definitive Charakterisierung des Reaktionsprodukts von O₂^{-} mit HE, die hier beschrieben wird, bildet die Grundlage für einen eindeutigen Test zur intrazellulären Erkennung und Quantifizierung von O₂^{-}. Die Analyse der Fluoreszeneigenschaften von Ethidium (E +) und 2-OH-E + deutet stark darauf hin, dass die derzeit verfügbaren Fluoreszenzmethoden nicht geeignet sind, um intrazelluläres O₂^{-} zu quantifizieren. Wir schließen daraus, dass der HPLC/Fluoreszenz-Test unter Verwendung von HE als Sonde besser geeignet ist, um reaktive Sauerstoffspezies zur Erkennung von intrazellulärem O₂^{-} nachzuweisen.
Zhao et al. (Mon,) haben diese Frage untersucht.