Ein Dual-Read-Out-Assay zur Bewertung der Potenz von Verbindungen, die gegen Mycobacterium tuberculosis aktiv sind

Tuberkulose ist ein ernsthaftes globales Gesundheitsproblem, das durch das Bakterium Mycobacterium tuberculosis verursacht wird. Es besteht ein dringender Bedarf an der Entdeckung und Entwicklung neuer Behandlungen, was jedoch nur durch schnelle und reproduzierbare M. tuberculosis-Assays erreicht werden kann, die darauf ausgelegt sind, potente Inhibitoren zu identifizieren. Wir haben einen automatisierten 96-Well-Assay entwickelt, der einen rekombinanten Stamm von M. tuberculosis verwendet, der einen farb-roten fluoreszierenden Reporter exprimiert, um die Aktivität neuartiger Verbindungen zu bestimmen; dies ermöglichte es uns, das Wachstum durch die Überwachung sowohl der optischen Dichte als auch der Fluoreszenz zu messen. Wir haben festgestellt, dass die optische Dichte und die Fluoreszenz mit der Zellzahl während des logarithmischen Wachstums korreliert waren. Die Fluoreszenz wurde über 5 Tage stabil ohne antibiotische Selektion gehalten, während dieser Zeit blieben die Zellen aktiv wachsend. Wir optimierten die Parameter für den Assay, wobei das endgültige Format 5 Tage Wachstum in 96-Well-Platten in Gegenwart von 2% w/v DMSO umfasste. Wir bestätigten die Reproduzierbarkeit mit Rifampicin und anderen Antibiotika. Die duale Erfassungsmethode ermöglicht eine reproduzierbare Berechnung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) und erkennt gleichzeitig Artefakte wie Fluoreszenzquenching oder Niederschlag von Verbindungen. Wir verwendeten unseren Assay, um die anti-tuberkulöse Aktivität zu bestätigen und die Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) um die Imidazo1,2-apyridin-3-carboxamide, eine vielversprechende Serie von M. tuberculosis-Inhibitoren, zu etablieren.