Cas-CLOVER ist eine neuartige hochpräzise Nuklease zur sicheren und robusten Erzeugung von TSCM-angereicherten allogenen CAR-T-Zellen

Die Verwendung von T-Zellen gesunder Spender für die allogene chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zellkrebstherapie ist attraktiv, da gesunde Spender-T-Zellen vielseitige, sofort einsatzbereite CAR-T-Behandlungen erzeugen können. Um die Sicherheit und Dauerhaftigkeit allogener Produkte zu maximieren, werden die endogenen T-Zell-Rezeptoren und Major-Histokompatibilitätskomplexe der Klasse I häufig durch Knockout des T-Zell-Rezeptor-beta-Konstanten (TRBC) (oder T-Zell-Rezeptor-alpha-Konstanten TRAC) und B2M entfernt. Allerdings können Genbearbeitungstools (z. B. CRISPR-Cas9) eine geringe Fidelity aufweisen, was zu gefährlichen Off-Target-Mutationen führen kann. Darüber hinaus erfordern viele Genbearbeitungstechnologien die Aktivierung von T-Zellen, was zu einem geringen Prozentsatz wünschenswerter Gedächtnis-STEM-Zellen (TSCM) führt. Wir charakterisieren eine RNA-geführte Endonuklease, die Cas-CLOVER genannt wird und aus der Clo051-Nukleasedomäne besteht, die mit katalytisch totem Cas9 fusioniert ist. In primären T-Zellen von mehreren Spendern stellen wir fest, dass Cas-CLOVER eine hochpräzise ortsspezifische Nuklease mit geringer Off-Target-Aktivität ist. Bemerkenswert ist, dass Cas-CLOVER effiziente multiplexe Genbearbeitung in ruhenden T-Zellen ermöglicht. In Verbindung mit dem piggyBac-Transposon zur Lieferung eines CAR-Transgenes gegen das B-Zell-Reifungsantigen (BCMA) produzieren wir allogene CAR-T-Zellen, die aus hohen Prozentsätzen von TSCM-Zellen bestehen und über starke in vivo antitumorale Zytotoxizität verfügen.