Produktion von homozygoten mutierten ES-Zellen mit einem einzelnen Targeting-Konstrukt.

Wir haben eine einfache Methode zur Herstellung embryonaler Stammzelllinien (ES-Zellen) entwickelt, bei der beide Allele durch homologe Rekombination inaktiviert wurden und die ein einzelnes Targeting-Konstrukt erfordert. Vier verschiedene ES-Zelllinien wurden erstellt, die heterozygot für Gene sind, die zwei Guanin-Nukleotid-bindende Proteun-Untereinheiten, alpha i2 und alpha i3, T-Zell-Rezeptor-alpha und beta-kardiakes Myosin-Schwere Kette kodieren. Als diese heterozygoten Zellen in hohen Konzentrationen von G418 gezüchtet wurden, waren viele der überlebenden Zellen homozygot für das targeted Allel und enthielten zwei Kopien des G418-Resistenzgens. Dieses Schema bietet eine einfache Methode zur Beschaffung homozygoter mutational veränderter Zellen, d.h. doppelter Knockouts, und sollte allgemein auf andere Gene und Zelllinien anwendbar sein, die keine ES-Zellen sind. Diese Methode sollte auch die Herstellung von Zelllinien ermöglichen, bei denen mehr als ein Gen in beiden Allelen gestört wurde. Diese mutierten Zellen sollten nützliche Werkzeuge zur Definition der Rolle bestimmter Gene in Zellkulturen liefern.