Entwicklung eines robusten qPCR-Assays zur Bewertung der DNA-Qualität und -Quantität für die gezielte Vorbereitung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken

Next-Generation-Sequencing (NGS) wird zum Standard für genetische Analysen klinischer Proben. DNA, die aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben gewonnen wird, ist häufig degradiert, und Proben wie Kernbiopsien sind manchmal zu klein, um genügend DNA für NGS-Anwendungen zu erhalten. Daher ist es wichtig, sowohl die DNA-Quantität als auch die Qualität genau zu messen. Es gibt jedoch kein standardisiertes Verfahren zur Analyse der DNA-Quantität und -Qualität für die NGS-Bibliotheksvorbereitung. Wir haben vier verschiedene Methoden (PicoGreen, Qubit®-Fluorometrie, TaqMan und SYBR-Green-basierten qPCR-Assay) getestet und jede mit RNase P TaqMan als Referenzkontrolle verglichen. Wir fanden heraus, dass der SYBR-Green-basierte qPCR-Assay eine konsistente und genaue DNA-Quantifizierung bietet, während die Kosten relativ niedrig und der Durchsatz hoch bleibt. Wir entwarfen einen Dual-Probe-SYBR-Green-qPCR-Assay zur Bewertung der DNA-Quantität und -Qualität für die gezielte NGS-Bibliotheksvorbereitung. Dieser Assay liefert einen Dscore (Degradationsscore) der untersuchten DNA, indem er zwei verschiedene Größen von Amplifikaten analysiert. Wir zeigen ein Beispiel einer klinischen Probe mit einem sehr hohen Dscore (hohe Degradation). Bei einer regulären DNA-Quantifizierung, ohne den Degradationsstatus zu berücksichtigen, wurden keine korrekten NGS-Bibliotheken erhalten. Nach der Optimierung der Bibliotheksbedingungen unter Berücksichtigung der schlechten DNA-Qualität wurden jedoch vernünftig gute Bibliotheks- und Sequenzierungsergebnisse erzielt. Zusammenfassend haben wir einen neuen qPCR-Assay zur Analyse der DNA-Quantität und -Qualität für die gezielte NGS-Bibliotheksvorbereitung entwickelt und vorgestellt. Dieser Assay könnte besonders effizient für klinische Proben mit hoher Degradation und schlechter DNA-Qualität sein.