Schnelles Messen von polymorphen Mikrosatellitenmarkern durch Kapillarelektrophorese

Genetische Kartierung und DNA-Sequenzierungsprojekte könnten potenziell schneller abgeschlossen werden, indem Kapillarelektrophorese (CAE)-Systeme verwendet werden, die 48-96 Kapillaren gleichzeitig betreiben. Derzeit werden multiplex-polimerase-kettenreaktion (PCR) und mehrfarbige fluoreszierende Farbstoffmarkierungsstrategien verwendet, um DNA-Profile mit 18-24 Genotypen pro Probe zu erzeugen. Durch die Verwendung von 4-Farben-Fluoreszenzdetektion und diesen multiplex-PCR-Strategien hat ein CAE-System die Kapazität, bis zu 5,5 Millionen Genotypen pro Jahr zu erzeugen. CAE bietet eine extrem schnelle, hochauflösende Trennung von DNA und eine automatisiertere Probenverarbeitung als herkömmliche Systeme, da die arbeitsintensiven Schritte des Gießens von Platten- Gelen und des Ladens von Proben entfallen. Wir verwendeten ein Prototyp-CAE-System in einer laufenden Verknüpfungsanalyse-Studie zur erblichen Taubheit in mediterranen Familien. CA-Wiederholungsmarker, die mit Genen zur Taubheitsempfindlichkeit auf den Chromosomen 7, 11 und 13 verknüpft sind, wurden analysiert und DNA-Profile erzeugt, die 6 Marker pro Farbe enthalten. Fragmentgrößen von über 28.000 kurzen tandemwiederholenden Allelen und 3200 CA-Wiederholungsallelen wurden durch CAE bestimmt. Eine durchschnittliche Größenpräzision von +/- 0,12 Basenpaaren (bp) für Fragmente bis zu 350 bp wurde in 1-stündigen Läufen erzielt. Darüber hinaus wurde eine vielseitige nicht-denaturierende Matrix verwendet, um DNA-Größenstandards, Restriktionsverdau und multiplex-PCR-Proben zu trennen. Die Anwendung dieser Matrix zum Screening von Exon-Deletion bei Duchenne-Muskeldystrophie wird ebenfalls beschrieben. Diese CAE-Ansätze sollten die schnelle Genotypisierung von Mikrosatellitenmarkern und die anschließende Identifizierung von krankheitsverursachenden Mutationen erleichtern.