Rekonstitution von Kaninchen-Thrombomodulin in Phospholipidvesikeln.

Der Einfluss von Phospholipiden auf die durch Thrombin-Thrombomodulin katalysierte Aktivierung von Protein C wurde untersucht, indem Thrombomodulin durch Dialyse aus Mischungen von Octylglucosid und Phospholipiden in Vesikel eingebaut wurde. Thrombomodulin wurde in Vesikel integriert, die von neutral (100% Phosphatidylcholin) bis stark geladen (30% Phosphatidylserin und 70% Phosphatidylcholin) reichten. Thrombomodulin ist in Vesikeln mit unterschiedlicher Phospholipidzusammensetzung zufällig orientiert. Die Integration von Thrombomodulin in Phosphatidylcholin, mit oder ohne Phosphatidylserin, verändert die Ca2+-Konzentrationsabhängigkeit der Protein C-Aktivierung. Lösliches Thrombomodulin zeigte eine halbmaximale Aktivierungsrate bei 580 µM Ca2+, während halbmaximale Aktivierungsraten von liposomen-rekonstituiertem Thrombomodulin zwischen 500 µM Ca2+ und 2 mM Ca2+ erhalten wurden, abhängig von der Zusammensetzung (Protein:Phospholipid) der Liposomen. Die Ca2+-Abhängigkeit der Protein C-Aktivierung passt für den löslichen Aktivator zu einer einfachen Hyperbel, während die Ca2+-Abhängigkeit des membranassoziierten Komplexes deutlich sigmoidal mit einem Hill-Koeffizienten größer als 2,4 ist. Im Gegensatz dazu bleibt die Ca2+-Abhängigkeit der gamma-Carboxyglutaminsäure (Gla)-domainlosen Protein C-Aktivierung durch die Membranrekonstitution unverändert (1/2 max = 53 +/- 10 µM) und passt zu einer einfachen rechteckigen Hyperbel. Die Integration von Thrombomodulin in reine Phosphatidylcholinvesikel reduziert das Km für Protein C von 7,6 +/- 2 auf 0,7 +/- 0,2 µM. Eine Erhöhung des Phosphatidylserinanteils auf 20% verringerte das Km für Protein C weiter auf 0,1 +/- 0,02 µM. Die Membranintegration hat keinen Einfluss auf die Aktivierung von Protein C, von dem die Gla-Reste proteolytisch entfernt werden (Km = 6,4 +/- 0,5 µM). Das bei Endothelzellen beobachtete Km ähnelt dem Km, das beobachtet wird, wenn Thrombomodulin (TM) in reine Phosphatidylcholinvesikel integriert wird, mehr als dem in negativ geladenen Vesikeln, was darauf hindeutet, dass die Protein C-Bindungsstelle auf Endothelzellen nicht negativ geladene Phospholipide umfasst. Zur Unterstützung dieses Konzepts beobachteten wir, dass Prothrombin und Fragment 1, die an negativ geladene Phospholipide binden, die Protein C-Aktivierung an Endothelzellen oder TM, das in Phosphatidylcholinvesikel integriert ist, nicht hemmen, aber dies tun, wenn TM in Phosphatidylcholin:Phosphatidylserin-Vesikel integriert ist. Diese Studien legen nahe, dass neutrale Phospholipide zu einer Exposition einer Stelle führen, wahrscheinlich auf Thrombomodulin, die in der Lage ist, die Gla-Domäne von Protein C zu erkennen.