Menschliches künstliches Chromosom mit einem bedingten Zentromer für Genübertragung und Genexpression

Menschliche künstliche Chromosomen (HACs), die ein voll funktionsfähiges Zentromer tragen und als einkopiertes Episom erhalten bleiben, sind nicht mit zufälliger Mutagenese assoziiert und bieten eine größere Kontrolle über die Expression von exogenen Genen auf dem HAC. Kürzlich erzeugten wir ein HAC mit einem bedingten Zentromer, das die Tetracyclin-Operator (tet-O)-Sequenz enthält, die in die alphoid-DNA-Anordnung eingebettet ist. Dieses bedingte Zentromer kann deaktiviert werden, Verlust des alphoid(tet-O) (tet-O HAC) durch Expression von tet-Repressor-Fusionsproteinen. In diesem Bericht beschreiben wir die Anpassung des tet-O HAC-Vektors für die Genübertragung und Genexpression in menschlichen Zellen. Ein loxP-Kassette wurde durch homologe Rekombination in Hühnerm DT40-Zellen in das tet-O HAC eingefügt, nachdem ein mikrozellvermittelter Chromosomenübertragungsprozess (MMCT) durchgeführt wurde. Das tet-O HAC mit der loxP-Kassette wurde dann in chinesische Hamster-Ovarzellen übertragen, und das EGFP-Transgen wurde effizient und genau in den tet-O HAC-Vektor integriert. Das EGFP-Transgen wurde nach der Übertragung über MMCT dauerhaft in menschlichen Zellen exprimiert. Da die transgenen Einfügungen im tet-O HAC durch den Verlust des HAC aufgrund der Deaktivierung des Zentromers aus den Zellen eliminiert werden können, bietet dieses HAC-Vektorsystem wichtige neuartige Merkmale und hat potenzielle Anwendungen für Genexpressionsstudien und Gentherapie.