Reaktionsmechanismus der Ca++-abhängigen ATPase des sarkoplasmatischen Retikulum aus Skelettmuskel*

Wir haben zuvor die Abhängigkeiten von der Konzentration von Ca++ und ATP der Ca++-abhängigen ATPase EC 3.6.1.3 Aktivität des sarkoplasmatischen Retikulum aus dem Skelettmuskel von Kaninchen berichtet. Wir haben auch die 82P-Inkorporation in das Enzym beobachtet, als es mit γ-82P-ATP in Gegenwart von Ca++ inkubiert wurde. Die P-Inkorporation nahm mit der Erhöhung der Ca++-Konzentration zu. Darüber hinaus war die Rate der Ca++-abhängigen ATPase-Aktivität proportional zur Menge an P-Inkorporation. In der vorliegenden Arbeit haben wir den Mechanismus der P-Inkorporation untersucht und die folgenden Ergebnisse erhalten. 1. Die Menge an P, die inkorporiert wurde, nahm mit steigendem pH zu und erreichte ein Maximum über pH 8,3. Die pH-Aktivitätskurve der Ca++-abhängigen ATPase war glockenförmig mit einem Maximum bei pH 7,0. Die pH-Abhängigkeit des Verhältnisses der ATPase-Aktivität zur Menge der 82P-Inkorporation deutete auf die Beteiligung einer funktionellen Gruppe mit einem pK-Wert von etwa 7,2 bei der Zersetzung des Enzym-Phosphat-Komplexes hin. 2. Als 2 mM EGTA nach der Bildung des Enzym-Phosphat-Komplexes hinzugefügt wurden, nahm die Menge des Komplexes schnell ab. Die Rate seiner Zersetzung nahm mit steigendem pH-Wert ab. Die Lebensdauer des Komplexes, die auf diese Weise gemessen wurde, stimmte gut mit dem kinetisch erhaltenen Wert überein, d.h. aus dem Verhältnis der ATPase-Aktivität zur Menge des Komplexes. 3. Als 2 mM kaltes ATP nach der Bildung des Enzym-82P-Komplexes hinzugefügt wurden, nahm die Menge an 82P, die inkorporiert wurde, mit der Zeit ab. Die Rate seines Abfalls war dreimal so hoch wie die, die nach der Zugabe von EGTA beobachtet wurde. 4. Die Zersetzungsrate des Enzym-Phosphat-Komplexes war unbeeinflusst von der Entfernung von Magnesiumionen, die für die Bildung des Enzym-Phosphat-Komplexes erforderlich waren. 5. Der durch TCA-Behandlung isolierte Enzym-Phosphat-Komplex war in saurer Umgebung stabil, aber in alkalischer Umgebung instabil. Der Komplex war in Gegenwart von 0,5 M Hydroxylamin sehr instabil.