Reinigung und Charakterisierung einer eih spezifischen NADase, eines Sekundärmessenger-Enzyms.

Eine eih spezifische NADase wurde aus dem Ovotestis des Opisthobranch-Mollusken Aplysia californica in homogene Form reinigt. Im Gegensatz zu anderen NADasen erzeugt das Aplysia-Enzym hauptsächlich zyklisches ADP-Ribose (cADPR) anstelle von ADP-Ribose aus NAD. cADPR hat sich als stimulierend für die Freisetzung von Ca2+ aus Mikrosomen erwiesen, die aus Seeigel-Eiern gewonnen wurden, und aktivierte bei Injektion in intakte Eier die kortikale Reaktion, mehrere nukleare Zyklen und die DNA-Synthese. Das Aplysia-Enzym wurde zunächst als Hemmer der cholera- und pertussis-toxin-katalysierten ADP-Ribosylierung identifiziert. Durch Verwendung eines NADase-Assays wurde es aus der wasserlöslichen Fraktion des Ovotestis durch sequenzielle Säulenchromatographie gereinigt. Das Enzym hat eine apparente Molekularmasse von 29 kDa, einen Km für NAD von 0,7 mM und eine Umdrehungsrate von etwa 27.000 mol NAD.min-1.mol Enzym-1 bei 30 Grad C. Monoklonale Antikörper wurden gegen die NADase erzeugt. Immunblots von zweidimensionalen Gelen zeigten mehrere Isoformen des Enzyms, mit pl-Werten von 8,1 bis 9,8. Die mehrfachen Isoformen wurden mit einer Kationenaustausch-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesäule aufgetrennt und erzeugten cADPR. Die immunhistochemische Analyse von Kryostat-Schnitten des Aplysia-Ovotestis zeigt, dass das Enzym spezifisch für die Eier und auf große Granulate oder Vesikel von 5 bis 10 Mikron beschränkt ist. Bis heute wurde die cADPR-erzeugende Enzymaktivität in verschiedenen Organismen identifiziert, einschließlich Säugetieren. Das Aplysia-Enzym ist das erste Beispiel, bei dem das Enzym, das cADPR erzeugt, gereinigt wurde. Alle verfügbaren Beweise deuten darauf hin, dass diese NADase ein Sekundärmessenger-Enzym ist, was impliziert, dass andere NADasen eine ähnliche Funktion haben können.