Identifizierung der wichtigsten physiologischen Phosphorylierungsstelle des menschlichen Keratins 18: mögliche Kinasen und eine Rolle bei der Filamentumorganisation.

Es gibt umfassende In-vitro-Beweise dafür, dass die Phosphorylierung von intermediate Filamenten, einschließlich Keratinen, eine wichtige Rolle bei der Filamentumorganisation spielt. Um ein besseres Verständnis der Funktion der Phosphorylierung von intermediate Filamenten zu erlangen, haben wir angestrebt, die Hauptphosphorylierungsstelle des menschlichen Keratinpolypeptids 18 (K18) zu identifizieren und ihre Rolle bei der Filamentassemblierung oder -umorganisation zu untersuchen. Wir erzeugten eine Reihe von K18 ser-->ala Mutationen an potenziellen Phosphorylierungsstellen, gefolgt von der Expression in Insektenzellen und dem Vergleich der tryptischen 32PO4-markierten Muster der erzeugten Konstrukte. Mit diesem Ansatz, verbunden mit der Edman-Abbau von den 32PO4-markierten tryptischen Peptiden und dem Vergleich mit tryptischen Peptiden, die nach der Markierung normaler menschlicher kolorektaler Gewebe analysiert wurden, identifizierten wir ser-52 als die Hauptphosphorylierungsstelle für K18. Ser-52 in K18 ist nicht glykosyliert und entspricht Konsenssequenzen für die Phosphorylierung durch CAM-Kinase, S6-Kinase und Protein-Kinase C, und all diese Kinasen können K18 in vitro überwiegend an dieser Stelle phosphorylieren. Die Expression des K18 ser-52-->ala-Mutanten in Säugetierenzellen zeigte minimale Phosphorylierung, aber keinen unterscheidbaren Unterschied in der Filamentassemblierung im Vergleich zu wildtypischem K18. Im Gegensatz dazu spielte die ser-52 Mutation eine klare, aber nicht exklusive Rolle bei der Filamentumorganisation, basierend auf der Analyse von Filamentveränderungen in Zellen, die mit okadaischer Säure behandelt wurden oder im G2/M-Stadium des Zellzyklus arretiert waren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ser-52 die Haupt-physiologische Phosphorylierungsstelle des menschlichen K18 in Interphase-Zellen ist und dass seine Phosphorylierung eine in vivo Rolle bei der Filamentumorganisation spielen kann.