Effekt von Verbindungssequenzen zwischen den variablen Antikörperdomänen auf die Bildung, Stabilität und biologische Aktivität eines bispezifischen Tandem-Diabodies

Bispezifische Einzelfaden-Fv-Antikörper bestehen aus vier kovalent verknüpften Immunoglobulin-variablen (V(H) und V(L)) Domänen mit zwei unterschiedlichen Spezifitäten, die durch drei Verbindungsstellen verbunden sind. Wenn sie in der Reihenfolge V(H)(A)-linker(1)-V(L)(B)-linker(2)-V(H)(B)-linker(3)-V(L)(A) zusammengebaut werden, faltet sich das Einzelfaden-Molekül entweder kopf-zu-schwanz zu einer diabody-ähnlichen Struktur, einem sogenannten bispezifischen Einzelfaden-Diabody, oder bildet ein Homodimer, das doppelt so groß ist, einen sogenannten Tandem-Diabody. Die Bildung des Tandem-Diabody wird durch die Assoziation komplementärer V(H) und V(L) Domänen bestimmt, die sich auf verschiedenen Polypeptidketten befinden, und hängt von der Länge und wahrscheinlich von der Aminosäurezusammensetzung der drei Verbindungsstellen ab, die die variablen Domänen verbinden. Wir erzeugten eine Reihe von Einzelfaden-Konstrukten unter Verwendung von vier V(H) und V(L) Domänen, die entweder für menschliches CD3, einen Bestandteil des T-Zell-Rezeptor (TCR)-Komplexes, oder für CD19, ein menschliches B-Zell-Antigen, spezifisch waren, getrennt durch verschiedene rational entworfene Peptid-Verbindungsstellen von 6-27 Aminosäureresten. Die erzeugten bispezifischen Konstrukte wurden im bakteriellen Periplasma exprimiert und ihre molekularen Formen, Antigenbindungs-eigenschaften, Stabilität sowie T-Zell-proliferative und anti-tumorale Aktivitäten wurden verglichen. Unter Verwendung von Kulturen von peripheren mononukleären Blutzellen von Patienten, die an B-Zell chronisch lymphatischer Leukämie leiden, zeigten wir, dass die tandab-vermittelte Aktivierung autologer T-Zellen und die Depletion maligner Zellen mit der Stabilität des rekombinanten Moleküls und mit dem Abstand zwischen den CD19- und CD3-Bindungsstellen korreliert.