Massen-spektroskopische Charakterisierung des Coronavirus infektiösen Bronchitisvirus-Nukleoproteins und Aufklärung der Rolle der Phosphorylierung bei der RNA-Bindung unter Verwendung der Oberflächenplasmone Resonanz

Die Phosphorylierung des Coronavirus-Nukleoproteins (N-Protein) wird als entscheidend für die RNA-Bindung angesehen. Um diese Hypothese zu untersuchen, analysierten wir die Kinetik der RNA-Bindung zwischen nicht-phosphoryliertem und phosphoryliertem N-Protein des Virus der infektiösen Bronchitis mit nicht-viraler und viraler RNA mittels Oberflächenplasmonresonanz (Biacore). Die massenspektroskopische Analyse des N-Proteins identifizierte Phosphorylierungsstellen, die nahe den RNA-Bindungsdomänen lagen. Die kinetische Analyse mittels Oberflächenplasmonresonanz deutete darauf hin, dass das nicht-phosphorylierte N-Protein mit gleicher Affinität an virale RNA bindet wie das phosphorylierte N-Protein. Dennoch hatte das phosphorylierte N-Protein eine höhere Bindungsaffinität zur viralen RNA als zur nicht-viralen RNA, was darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung des N-Proteins die Erkennung der Virus-RNA bestimmte. Die Daten zeigten auch, dass eine bekannte Bindungsstelle des N-Proteins (die an der transkriptionalen Regulation beteiligt ist), die aus einer konservierten Kernsequenz besteht, die in der Nähe des 5'-Endes des Genoms (in der Führungssequenz) vorhanden ist, durch die Förderung hoher Assoziationsraten der N-Protein-Bindung funktionierte. Weitere Analysen der Führungssequenz zeigten, dass das Kernelement nicht die einzige Bindungsstelle für das N-Protein war und dass andere Regionen die hochaffine Bindung förderten.