Mapping in vivo Assoziationen von zytoplasmatischen Proteinen mit Mutanten des zytoplasmatischen Domäne des Integrin beta 1.

Integrine fördern die Bildung von fokalen Adhäsionen und aktivieren intrazelluläre Signalwege durch zytoplasmatische Proteine wie Talin, Alpha-Aktinin und fokale Adhäsionskinase (FAK). Die beta 1 Integrin-Untereinheit hat gezeigt, dass sie in In-vitro-Tests an Talin und Alpha-Aktinin bindet, und diese Proteine können Integrin entweder direkt oder über Verbindungen zu anderen Proteinen wie Vinculin mit dem Aktin-Zytoskelett verknüpfen. Es ist jedoch unklar, welche dieser Assoziationen in vivo notwendig sind für die Bildung fokaler Kontakte oder welche Regionen des beta 1 Integrins an spezifische zytoskeletale Proteine in vivo binden. Wir haben einen in vivo-Test entwickelt, um diese Fragen zu klären. Mikroperlen wurden mit anti-Hühnchen beta 1 Antikörpern beschichtet, um gezielt Hühnchen beta 1 Integrine zu clustern, die in kultivierten Mausfibroblasten exprimiert wurden. Die Fähigkeit von Mutanten des zytoplasmatischen Domänes von beta 1 Integrinen, die Ko-Lokalisierung von Proteinen zu induzieren, wurde durch Immunfluoreszenz bewertet und mit der von Wildtyp-Integrin verglichen. Wie erwartet hatte der Mutant beta 1, dem die gesamte zytoplasmatische Domäne fehlt, eine reduzierte Fähigkeit, die Ko-Lokalisierung von Talin, Alpha-Aktinin, F-Aktin, Vinculin und FAK zu induzieren. Die Fähigkeit des beta 1 Integrins, Talin und FAK zu ko-lokalisieren, erforderte eine Sequenz in der Nähe des C-Terminus von beta 1. Die Region von beta 1, die erforderlich ist, um Alpha-Aktinin zu ko-lokalisieren, befand sich in einer anderen Sequenz, die mehrere Aminosäuren weiter vom C-Terminus von beta 1 entfernt war. Die Löschung von 13 Resten vom C-Terminus blockierte die Ko-Lokalisierung von Talin, FAK und Aktin, jedoch nicht von Alpha-Aktinin. Die Assoziation von Alpha-Aktinin mit gruppierten Integrin reicht daher nicht aus, um die Ko-Lokalisierung von F-Aktin zu induzieren.