Induktion und biochemische Reinigung des RNA-induzierten Silencing-Komplexes aus Drosophila S2-Zellen

Die Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi) hat den Prozess der Genunterdrückung in vielen experimentellen Systemen, einschließlich Caenorhabditis elegans, Drosophila und Säugetierzellen, erheblich vereinfacht. Ein sequenzspezifischer Nuklease-Komplex, der als RNA-induzierter Silencing-Komplex (RISC) bezeichnet wird, kann aus Zellen, die RNAi durchlaufen, gereinigt werden. RISC zeigt RNase-Aktivität, wenn es RNAs ausgesetzt ist, die homolog zu den eingespeisten doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) sind, hat jedoch keine Aktivität in Gegenwart von nicht zielgerichteten RNAs. Wir beschreiben die Induktion von RNAi durch dsRNA in kultivierten Drosophila Schneider-2 (S2)-Zellen und erläutern Verfahren zur RISC-Reinigung aus diesen Zellen. Dieser Reinigungsansatz hat es uns ermöglicht, mehrere RISC-Komponenten zu identifizieren, einschließlich siRNAs, Argonaut 2 (Ago-2), Drosophila fragile X verwandtes Protein (dFXR), Vasa-intronisches Gen (VIG) und das Mitglied der mikrokuppelförmigen Nuklease-Familie Tudor-SN (Drosophila CG7008). RNAi wird durch einen endogenen Weg durchgeführt, der für die normale Entwicklung vieler Organismen wichtig ist. Tatsächlich exprimieren Organismen Hunderte von verschiedenen Mikro-RNAs (miRNAs), kleinen Haarnadel-RNAs, die über den RNAi-Weg die Expression endogener Gene unterdrücken. Die Funktion von miRNAs ist schlecht verstanden, und die meisten ihrer Ziele sind unbekannt. Gereinigte RISC-Komplexe enthalten kurze interferierende RNAs und endogen exprimierte miRNAs und werden nützlich sein, um viele Aspekte der RNAi-Maschine zu untersuchen.