Phosphorylierung durch Protein-Kinase A von RCK1 K+ Kanälen, die in Xenopus-Oozyten exprimiert werden

Die phosphorylierungsbedingte Regulation von spannungsgesteuerten K+ Kanälen wurde in zahlreichen elektrophysiologischen Studien behandelt; jedoch wurden komplementäre biochemische Studien bislang durch das Scheitern, K+ Kanalproteine mit unterschiedlicher molekularer Identität zu isolieren und zu charakterisieren, behindert. Wir nutzten das Xenopus-Oozyten-Expressionssystem, um die Biosynthese und Phosphorylierung durch die Protein-Kinase A (PKA) des Rattenhirn-RCK1 (Kv1.1) K+ Kanalproteins zu untersuchen. Das RCK1-Protein wurde durch Immunpräzipitation aus in RCK1 cRNA injizierten Oozyten isoliert und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Das Kanalprotein wurde in Form mehrerer Polypeptide exprimiert. Das 57-kDa Polypeptid, normalerweise der Hauptbestandteil, befand sich sowohl im Zytosol als auch in der Plasmamembran. Sein Gehalt korrelierte mit den RCK1-Stromamplituden (IRCK1) und bei Inkubation der mit cRNA injizierten Oozyten mit Tunicamycin wurde sein Molekulargewicht verringert und gleichzeitig IRCK1 reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die membranären 57-kDa Polypeptide funktionale Kanäle darstellen, die N-glycosyliert sind. Darüber hinaus zeigte eine Untersuchung der Phosphorylierung der RCK1-Polypeptide, dass das 57-kDa Polypeptid spezifisch für die Phosphorylierung durch PKA angesprochen wurde. Es konnte in vitro durch die katalytische Untereinheit von PKA (PKA-CS) phosphoryliert werden. In seinem natürlichen Zustand in intakten Oozyten war das 57-kDa Polypeptid teilweise phosphoryliert und konnte in vivo weiter phosphoryliert werden durch Zugabe eines membranpermeablen cAMP-Analogons. Die standortgerichtete Mutagenese zeigte, dass die Phosphorylierung eines einzelnen Standorts am C-Terminus des Kanalproteins vollständig für diese Phosphorylierungen verantwortlich ist. (DAS ZUSAMMENFASSUNG WURDE BEI 250 WÖRTERN ABGESCHNITTEN)