Bindung und Spaltung von CRISPR-RNA durch Cas6

Das CRISPR-Cas-System bietet vielen Prokaryoten eine erworbene Resistenz gegen Viren und andere mobile genomische Elemente. Die Kernkomponenten dieses Abwehrsystems sind kleine, vom Wirt kodierte prokaryotische Silencing (psi)RNAs und Cas (CRISPR-assoziierte) Proteine. Von Invasoren abgeleitete Sequenzen innerhalb der psiRNAs lenken Cas-Effektorproteine an, um Invasoren-Nucleinsäuren zu erkennen und zu stillzulegen. Kritisch für die CRISPR-Cas-Abwehr ist die Verarbeitung der psiRNAs aus den primären Transkripten des CRISPR-Locus (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) des Wirts. Cas6, eine zuvor identifizierte Endoribonuklease, die in einer Vielzahl von Prokaryoten mit dem CRISPR-Cas-System vorhanden ist, bindet und spaltet innerhalb der sich wiederholenden Sequenzen, die die einzelnen Invasoren-zielenden Elemente im Transkript des CRISPR-Locus trennen. In der vorliegenden Studie untersuchten wir mehrere Schlüsselaspekte des Wirkmechanismus von Cas6 in der Biogenese von psiRNA. RNA-Footprinting zeigt, dass Pyrococcus furiosus Cas6 an eine 7-nt (Nukleotid) Sequenz am 5'-Ende der CRISPR-RNA-Wiederholungssequenz bindet, 14 nt stromaufwärts der Cas6-Spaltstelle. Darüber hinaus deutet die Analyse der Spaltungstätigkeit von P. furiosus Cas6-Proteinen mit Mutationen an konservierten Resten darauf hin, dass ein Triade bestehend aus Tyr31, His46 und Lys52 eine entscheidende Rolle bei der Katalyse spielt, was mit einem möglichen allgemeinen Säure-Base-RNA-Spaltungsmuster für Cas6 übereinstimmt. Schließlich zeigen wir, dass P. furiosus Cas6 stabil mit seinen Spaltprodukten assoziiert bleibt, was auf zusätzliche Rollen für Cas6 in der Biogenese von psiRNA hindeutet.