Transkriptions-gekoppelte Veränderungen der nuklearen Mobilität von Säugetier-Cis-regulatorischen Elementen

Um eine Multiplexierung von Leit-RNAs (gRNAs) zu erreichen und eine effiziente Zustellung von Dutzenden unterschiedlicher gRNAs in einzelne Zellen zu ermöglichen, entwickelten wir eine molekulare Montage-Strategie namens chimerisches Array von gRNA-Oligonukleotiden (CARGO). Wir kombinierten CARGO mit dCas9 (katalytisch inaktivem Cas9) Imaging, um die Bewegung von Enhancern und Promotoren quantitativ zu messen, die Veränderungen der Aktivität im Zusammenhang mit der Differenzierung in lebenden embryonalen Stammzellen erfahren. Während alle untersuchten funktionalen Elemente subdiffusives Verhalten zeigten, nahm ihre relative Mobilität gleichzeitig mit der Transkriptionsaktivierung zu. Darüber hinaus kann eine akute Störung der RNA-Polymerase-II-Aktivität diese aktivitätsbedingten Zunahmen der Mobilität an den Loci umkehren. Durch quantitative CARGO-dCas9-Imaging liefern wir direkte Messungen der Dynamik von Cis-regulatorischen Elementen in lebenden Zellen und unterschiedlichen zellulären und Aktivitätszuständen und entdecken eine intrinsische Verbindung zwischen der Mobilität von Cis-regulatorischen Elementen und der Transkription.